研究组长：张余，研究员
主要研究方向及内容：基因组中的遗传信息得以表达，需要RNA聚合酶进行转录。以DNA为模板合成RNA的转录过程不仅是基因表达第一步，还是基因表达的主要调控步骤。因此对RNA聚合酶分子机器结构、运行机理以及调控机制的研究能够回答基因表达精密调控的基础生物学问题。同时细菌之间RNA聚合酶非常保守，而细菌与人RNA聚合酶保守性较差，因此细菌RNA聚合酶是抗细菌药物的优良靶点，现有两类靶向细菌RNA聚合酶的临床使用抗生素--利福平(Rifamycins)与非达酶素(Fidaxomicin)。
本课题组围绕多亚基RNAP 分子机器为中心，探索转录的分子机理和调控机制，同时以细菌的RNA聚合酶为靶点，开发新型的抗生素，本课题组结合生物化学、结构生物学以及微生物学等手段研究以下几方面内容：
1. 细菌RNA聚合酶转录起始分子机制
2. 转录起始因子调控细菌转录分子机制
3. 细菌转录与DNA修复关联的分子机制研究
4. 细菌RNA聚合酶转录终止分子机制
5. 新型RNA聚合酶转录调控蛋白的挖掘以及机制研究
6. 以细菌RNA聚合酶为靶点的新型抗生素发现
研究队伍：
工作人员：闫智（研究实习员）
研究生：李玲婷、章洪伟、武霄仙、尤琳琳、方城力、俞承志、曾媛、何定伟、董尚志、李国强、黄坤、谷战西
联合培养生：赵依寒（河南大学）、穆文慧（河南大学）
年度研究进展
1.捕获细菌RNA聚合酶转录起始后期的动态过程
基因转录起始需要RNA聚合酶和转录起始因子σ组成复合物，再一起锚定到基因的启动子区域，解开双链DNA，起始RNA合成。在这个过程中，RNA聚合酶与大约60-bp DNA建立牢固的相互作用，以确保转录起始的高效进行。然而，RNAP随后必须完全挣脱上述相互作用才能启航完成RNA的延伸，这一过程称为promoter escape。RNA聚合酶从哪里获得能量，并且如何积累能量来实现promoter escape，一直是大家感兴趣的问题。
该研究发现在细菌，真核和古菌这三界生物中，转录起始因子都存在一个结构模块(在细菌中为σ finger)，这个模块深入到RNAP的催化中心，在RNA聚合酶解链双链DNA的时候，其能够稳定单链的转录泡结构。但是该结构模块的位置却堵住了新生RNA的延伸路径。在RNA的延长过程中，它势必会与RNA发生冲突。在这项研究中，作者解析了细菌转录起始阶段的大约20个复合物晶体结构，还原了这一个冲突的细节。作者发现，RNA的延长会逐渐挤压σ finger，并最终将其推出RNAP聚合酶中心，根据结构信息，作者提出了promoter escape分子机制的假设。作者认为σ finger相当于一个弹簧，RNA在刚开始延长的过程中不断的挤压这一弹簧，能够将NTP水解的自由能不断转换成机械能，并积累到σ finger的蛋白弹簧上，当这一弹簧被挤压到极限时能够促发RNAP与启动子DNA的解离，完成Promoter escape。这一假设与15年前提出的DNA弹簧（DNA scrunching）理论相互补充，完善了promoter escape的的分子机制。
张余研究组的李玲婷博士生和Rutgers university的Vadim Molodtsov博士是论文的共同第一作者，张余研究员与Rutgers university的Richard Ebright教授是该论文的共同通讯作者。该研究得到了中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金和中科院重点部署项目的资助。
2.揭示细菌Class III转录激活机制
大约50年前，法国著名科学家Jacob和Monod发现乳糖操纵子，首次提出基因表达受到蛋白调控1。阻遏蛋白Lac I和代谢物激活蛋白CRP (cAMP receptor protein; 也被称为catabolite activator protein, CAP )紧接着被证明能够直接结合乳糖操纵子，分别发挥转录抑制和转录激活的功能2, 3。随后大家对转录因子如何抑制以及激活转录发生了浓厚的兴趣。大约30年前，Thomas A. Steitz课题组解析了CAP/CRP与DNA的复合物晶体结构4，该结构首次展示了转录因子识别DNA的方式。在随后的几十年中，科学家们利用化学交联、DNA足迹、遗传突变等方法尝试了解转录因子调控基因转录的具体机制，大家发现转录因子在启动子DNA的结合位置直接决定了其对于下游基因的影响，一般来讲，转录因子结合在核心启动子区域（-35区和-10区）上游发挥转录激活功能，转录因子结合在核心启动子区域或者基因内部则抑制转录。而转录激活按照转录因子结合位点距离核心启动子区域远近又分为两类，结合位点位于启动子核心区域上游为第一类转录激活（Class I）,而结合位点与启动子核心区域稍有重叠称为第二类转录激活（Class II）5。直到2016年和2017年，Richard H. Ebright和Thomas A. Steitz课题组以CAP为模型，在Science杂志上报导了细菌Class I与II转录激活因子与RNA聚合酶以及启动子DNA的复合物结构，揭示了经典的转录激活分子机制6, 7。总的来讲，它们通过DNA结合结构域与启动子DNA相互作用，通过其转录激活结构域与RNA聚合酶相互作用，通过将RNAP聚合酶富集到其调控的启动子DNA区域激活转录。
在探索CAP转录激活机制的同时，David C. Fritzinger发现了一种机制特异的转录因子MerR 8，它能够结合在耐汞基因簇启动子核心区域，与RNAP的结合位置完全重叠，在一般情况下抑制下游基因表达，而胞内汞离子浓度高时，则激活下游基因表达。这种现象与上述Class I和Class II的转录激活调控方式完全相悖，因为MerR的结合位置与RNAP结合位置完全重叠，按照之前的规律其应该只发挥转录抑制功能，并且MerR调控的基因启动子DNA的-35区和-10区间隔为19bp，而细菌RNA聚合酶只能识别-35区和-10区间隔为17±1的启动子。随后大家在很多细菌中都发现了该类转录因子的存在，于是这类蛋白被命名为MerR家族转录因子，它们能够感受胞内的金属离子，氧化状态，以及抗生素胁迫。从20世纪90年代开始，大家利用DNA足迹手段，发现MerR处于抑制态和激活态时，其结合的启动子DNA构象可能有较大的的构象变化。Thomas V. O’ Halloran课题组针对MerR家族蛋白进行了大量的晶体结构研究，它们从2003到2015年分别解析了CueR apo protein, CueR-DNA二元复合物，以及CueR-Ag+-DNA三元复合物的晶体结构解析，阐明了该家族成员在不结合配体时，结合标准的B型双链DNA，而结合配体后，能够使B型双链DNA发生约90度的弯折，使其局部区域呈现A型双链DNA的构象。这为该类转录因子的激活机制更加增加了一层神秘的面纱。鉴于其转录调控方式的特殊性，大家将MerR家族转录激活方式命名为非典型的转录激活或者Class III转录激活。
为了揭示MerR家族转录因子的转录激活机制，在该论文中，作者以大肠杆菌中感应银离子和亚铜离子的CueR蛋白为对象，解析了CueR、Ag+、启动子DNA以及RNA聚合酶的转录激活复合物电镜结构。结构显示CueR结合在启动子DNA的两个关键区域-35区和-10区之间，使双链DNA在四个位置发生了较大程度弯折，特别是位于CueR二聚体中心的位置，DNA发生了约90度的弯曲。这种由CueR结合导致的启动子DNA弯曲，使 19bp的-35/-10间隔区域重新压缩到了17bp的物理距离，从而使RNA聚合酶能够成功该启动子DNA启动下游基因转录。另外，该复合物结构显示虽然CueR在启动子DNA上的结合位点与RNAP聚合酶的结合位点完全重叠，但是CueR结合在启动子DNA的一侧，而RNAP结合在启动子的另一侧，CueR与RNA聚合酶没有相互作用，二者互不干扰，而这一点也与Class I以及Class II的转录激活机制完全不同。最后，该研究解析了以CueR为代表的细菌Class III转录激活复合物结构，揭示了该类转录激活蛋白不依赖与RNA聚合酶的相互作用，仅通过改变DNA构象激活转录的分子机制。
论文第一作者为张余课题组博士生方城力和美国西北大学（Northwestern University）Steven J. Philips博士。浙江大学医学院冯钰研究员，美国西北大学Thomas V. O’Halloran教授以及张余研究员是该论文的通讯作者。感谢浙江大学电镜中心以及国家蛋白质中心（上海）对于本课题的大力支持，特别是感谢蛋白中心在疫情期间批准的紧急电镜机时和孔亮亮老师在疫情期间对我们数据收集的帮助。该研究受到国家自然科学基金、中科院先导B以及上海市科技创新行动计划的资助。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-020-00653-x
年度代表性论文：
1. Fang C.*, Philips S.J.*, Wu X, Chen K, Shi J, Shen L, Xu J, Feng Y.** , Thomas V. O’Halloran .** , Zhang Y.**. CueR activates transcription through a DNA distortion mechanism. Nature Chemical Biology 2020,doi: 10.1038/s41589-020-00653-x
2. Wang F.*, Shi J.*, He D.*, Tong B, Zhang C, Wen A, Zhang Y.** , Feng Y.** , Lin W.**. Structural basis for transcription inhibition by E. coli SspA,Nucleic Acids Research2020,48(17):9931-9942.
3. Huang W, Zhang Y, Shen L, Fang Q, Liu Q, Gong C, Zhang C, Zhou Y, Mao C, Zhu Y, Zhang J, Chen H, Zhang Y, Lin Y, Ralph Bock, Zhou F.**. Accumulation of the RNA polymerase subunit RpoB depends on RNA editing by OsPPR16 and affects chloroplast development during early leaf development in rice.New Phytologist2020,doi: 10.1111/nph.16769.
4. Li L.*, Molodstov V.*, Lin W, Ebright R.H.**, Zhang Y.**. RNA extension drives a stepwise displacement of an initiation-factor structural module in initial transcription.PNAS2020,117(11):5801-5809.
