天然产物合成生物学研究组----中国科学院分子植物科学卓越创新中心/中国科学院上海植物生理生态研究所

天然产物合成生物学研究组

研究组长：王勇，研究员、实验室副主任

主要研究方向及内容：本课题组主要从事天然产物的合成生物学研究。研究内容涉及各种与天然产物合成相关的基因、模块、途径和宿主等资源的分离、鉴定；天然产物的合成生物学设计与异源合成等。基于合成生物学人工设计的原理，获得可用于药物研发的天然的或非天然的复杂次生代谢产物；改进复杂天然产物的生物合成效率和其生产方式，是我们研究的核心内容。具体内容包括：1. 天然产物生物合成元件的筛选; 2. 天然产物生物合成宿主的设计与改造; 3.代谢途径工程、生物过程工程及生物反应器工程研究。

研究队伍：

工作人员：刘海利（副研究员）、李建华（高级工程师）、吕华军（助理研究员）、孙雨伟（助理研究员）

博士后：

研究生：刘志凤、邵洁、陈卓、田晨菲、张前、许建林、张英、毛亚平、张玉连、冯占广、朱江明

联合培养生：计东尼（华东理工大学），许方琳（河南大学）

年度研究进展

(1)二萜糖基转移酶SrUGT76G1的催化机制

糖基转移酶介导的天然产物糖基化是次生代谢产物生物合成中最广泛存在的一种修饰方式，也是植物细胞维持代谢平衡的主要机制之一，决定了次级代谢产物的水溶性、生物活性、稳定性、毒性、运输性及亚细胞定位等。迄今为止，人们对这类糖基转移酶的底物识别专一性和产物生成特异性的分子机制仍知之甚少。在本项工作中，作者对甜叶菊来源的具有广泛底物催化活性的二萜糖基转移酶SrUGT76G1进行了蛋白结构与催化机制的研究，发现该酶能识别多种二萜及其他小分子化合物生成相应的糖基化产物。作者获得了SrUGT76G1与四种不同底物的复合物的晶体结构，发现SrUGT76G1之所以能够识别多种不同的底物，在于其宽大的糖基受体结合口袋，这与已知的黄酮或水杨酸糖基转移酶具有明显的不同。进一步的研究发现，Gly87与Leu204是决定SrUGT76G1底物识别特异性的关键残基，突变可实现二萜糖基转移酶对底物的识别的转换，即由二萜转换为黄酮。研究同时发现, Thr284是决定底物识别专一性与产物特异性的关键位点。基于此，作者成功地实现了以莱宝迪苷D（RebD）为底物高效合成稀有的高倍甜味剂莱宝迪苷M（RebM），降低了该酶对底物莱宝迪苷A（RebA）的识别，大大减少了副产物莱宝迪苷I（RebI）的生成。本研究工作揭示了二萜糖基转移酶底物识别与催化的分子机制，为通过糖基化工程合成更多结构和功能多样性的天然或非天然糖基化产物奠定了分子基础。本研究也提供了一种高效便捷的方式，可通过合成生物技术大规模制造RebM等植物中稀有的二萜糖苷类化合物，目前该技术已成功实现了工业化推广。

(2)黄酮碳苷化合物的生物合成及镇痛活性

竹子是一种单子叶禾本科植物，具有悠久的药食两用历史，被认为能够“清热除烦，生津利尿”。竹叶中的黄酮成分是其主要的药效物质，但其生物合成和药理学机制都缺乏深入研究。本研究对竹叶中稀有的碳苷黄酮进行了研究。相比于常见的氧苷黄酮，碳苷黄酮在自然界来源稀少，但其结构更加稳定，也具有更多样的药理活性。研究者对禾本科植物黄酮碳苷产物谱进行的研究，发现了该类化合物在不同禾本科植物中有其进化上的分布规律。玉米、谷子等PACMAD分支的作物主要生产黄酮单糖碳苷，而BOP分支（水稻、小麦等）主要生产黄酮双糖碳苷。通过比较基因组分析，研究者在水稻、二穗短柄草、毛竹、小麦、玉米、高粱和谷子的基因组共线性区域中发现了可能参与黄酮碳苷的生物合成的32个呈串联重复排列的UGT708A家族糖基转移酶。进一步的进化分析发现这些糖基转移酶可分成A、B两个分支。体外功能验证表明，这些UGT参与了黄酮碳苷途径中间体2-羟基柚皮素的碳苷糖基化。其中A分支是严格的以UDP-葡萄糖为底物的糖基转移酶，而B分支对糖基供体的识别具有杂泛性，可以同时识别UDP-葡萄糖和UDP-阿拉伯糖。研究者又进一步深入挖掘了禾本科植物中参与稀有碳苷黄酮合成的其他酶。从毛竹基因组中挖掘了两个未知的黄酮羟化酶，与柚皮素前体合成模块、碳苷糖基化模块共同整合至大肠杆菌底盘细胞中后验证了它们的功能。通过利用不同物种（水稻、玉米、高粱、毛竹、拟南芥）来源的黄烷酮2位羟化酶和黄烷酮3’位羟化酶的正交组合，研究者最终在大肠杆菌系统中成功实现了荭草苷、异荭草苷、牡荆素和异牡荆素等四种稀有黄酮碳苷的从头合成，在摇瓶中其产量均达到20~30 mg/L水平。

研究者又进一步对这些碳苷黄酮单体的活性进行了评价，发现异荭草苷（isoorientin）具有显著的抑制疼痛活性。其在小鼠福尔马林致痛实验I相的镇痛作用与阳性对照药物罗通定相当，II相的镇痛作用与阳性对照药物阿司匹林相当。进一步的靶标实验发现，异荭草苷可以抑制福尔马林诱导的TNF-α的产生，并以剂量依赖的方式增加抗痛觉过敏细胞因子IL-10的产生发挥抗炎镇痛的作用，通过靶向TRPV1和NR2B信号通路实现神经保护镇痛。本研究阐明了竹子等禾本科植物中稀有黄酮碳苷的合成途径，并对这些碳苷单体的抗炎镇痛作用进行了评价，揭示了其可能的药理机制。为深入开发禾本科植物资源及其所蕴含的稀有活性成分奠定了基础。

年度代表性论文：

1. Shao J, Sun Y, Liu H, Wang Y* (2021). Pathway elucidation and engineering of plant-derived diterpenoids. Curr Opin Biotechnol.69:10-16.

2. 邵洁，刘海利，王勇*（2020），植物合成生物学的现状与未来，合成生物学，1（4）：390-406

3. Sun Y, Chen Z, Yang J, Mutanda I, Li S, Zhang Q, Zhang Y, Zhang Y, Wang Y* (2020), Pathway-specific enzymes from bamboo and crop leaves biosynthesize anti-nociceptive C-glycosylated flavones, Commun Biol, 3(1):110.

4. Dong N, Sun Y, Guo T, Shi C, Zhang Y, Kan Y, Xiang Y, Zhang H, Yang Y, Li Y, Zhao H, Yu H, Lu Z, Wang Y, Ye W, Shan J, & Lin H* (2020). UDP-glucosyltransferase regulates grain size and abiotic stress tolerance associated with metabolic flux redirection in rice. Nat Commun, 11(1), 2629. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16403-5

5. Chen Q, LiJ, LiuZ, MitsuhashiT, ZhangY, Liu H, MaY, He J,ShinadaT, SatoT, Wang Y, LiuH, AbeI, Zhang P, Wang G*, Molecular Basis for Sesterterpene(C25) Diversity Produced by Plant Terpene Synthases, Plant Commun (2020), doi: https://doi.org/10.1016/j.xplc.2020.100051.

6. Liu Z, Li J, Sun Y, Zhang P*, Wang Y* (2020)，Structural Insights into the Catalytic Mechanism of a Plant Diterpene Glycosyltransferase SrUGT76G1, Plant Commun, 1(1)：100004，DOI: 10.1016/j.xplc.2019.100004