微生物代谢工程与比较基因组学研究组----中国科学院分子植物科学卓越创新中心/中国科学院上海植物生理生态研究所

微生物代谢工程与比较基因组学研究组

研究组组长：杨琛，研究员、实验室副主任

主要研究方向及内容：本课题组致力于细胞代谢网络运转及调控机制的定量研究，实现其人工设计与系统优化。主要研究兴趣包括：1）开发代谢流量分析与代谢组学分析技术；2）定量研究细胞代谢网络运转机制，揭示各种分子机制对代谢流量的调节与控制；3）开展光能自养微生物以及菌群的合成生物学研究。

研究队伍：

工作人员：高方、朱虹

博士后：聂小群

研究生：刘玉洁、王甜甜、董文越、周洁、周海燕、李虎、程文波、席华超、付涵

年度研究进展

1. 解析拜氏梭菌转录调控蛋白AdhR的调控机制

梭菌作为厌氧细菌，主要通过发酵产物的形成特别是醇的合成来维持细胞的氧化还原平衡。尽管已经发现在丙酮丁醇梭菌中，转录因子Rex能够通过响应细胞氧化还原状态调节发酵产物的形成和氧化应激的耐受性，但维持其他梭状芽胞杆菌如拜氏梭菌C. beijerinckii中的氧化还原平衡的调节机制仍知之甚少。

AdhR是在拜氏梭菌等多个梭菌中保守存在的一类Sigma-54依赖的转录蛋白。利用体外结合实验和体内转录激活实验发现，AdhR和Sigma-54共同调控着拜氏梭菌中的主要醇脱氢酶adhA1和adhA2。我们还识别了拜氏梭菌AdhR与adh基因启动子上游直接结合的三个UAS位点，UAS位点的缺失或AdhR的拜氏梭菌突变体表现出严重受损的丁醇和乙醇合成能力（图1AB）。此外，我们进一步探讨了AdhR的调控机制。通过分析N末端截短的AdhR的ATPase活性，发现了AdhR活性的分子内控制机制，即蛋白中间AAA⁺结构域受到N末端GAF和PAS结构域的抑制。进而通过厌氧条件下体外蛋白重构实验发现Fe²⁺与GAF结构域的结合可解除分子内阻遏并激活AdhR的ATPase活性，从而使AdhR激活转录。这种控制机制使AdhR能够通过结合Fe²⁺响应细胞氧化还原状态来调节adhA1和adhA2的转录。此外，我们通过添加甲酸或接触O₂来干扰细胞氧化还原平衡，发现AdhR或Sigma-54失活突变体的胞内NADH/NAD⁺比值相比野生型发生了较大变化，而且突变体具有更差的氧化还原应激的耐受性，说明AdhR的存在能够帮助细胞应对氧化还原水平的扰动。我们的研究结果表明，AdhR能够感知细胞内的氧化还原状态，并和Sigma-54控制醇的合成来维持拜氏梭菌细胞内氧化还原的稳态（图1C）。我们的研究揭示了Sigma-54及其转录调控蛋白的一种全新的调控功能，即对氧化还原平衡的调控，同时首次发现GAF结构域能够通过结合Fe²⁺来响应和传递氧化还原信号。

2. 分枝杆菌新型转录调控蛋白FdmR的功能鉴定和代谢调控机制解析

结核分枝杆菌感染所引起的结核病是严重危害人类健康的传染性疾病。据统计，目前有近15亿人感染了结核分枝杆菌，每年超过一百万人死于结核病。宿主来源的脂肪酸是结核分枝杆菌在感染过程中的一种重要的碳源，许多参与脂肪酸代谢的基因是结核分枝杆菌感染和长期潜伏的必需基因。但分枝杆菌如何响应宿主脂肪酸信号以调控其分解代谢的动态过程，仍然缺乏系统的认识。

我们在分枝杆菌属中识别了一个TetR家族的转录调控蛋白FdmR，分布于结核分枝杆菌、海分枝杆菌等多个致病菌。结合比较基因组学的方法，我们在多组分枝杆菌基因组中重构了FdmR转录调节子，发现FdmR是一个全局性的转录因子，调控了多个脂肪酸氧化和脂肪酸修饰相关的基因(图2A)。因此，我们预测FdmR是分枝杆菌中一个调控脂肪酸代谢的新型转录因子，并以模式菌—海分枝杆菌及其天然宿主斑马鱼为研究对象，结合¹³C动态代谢流量分析技术、转录组、代谢组和脂质组等方法全面解析该调控蛋白的调控方式和生理功能。首先，我们在海分枝杆菌中利用同源重组法构建了fdmR基因的敲除株，并研究其侵染表型。结果显示海分枝杆菌FdmR突变株在斑马鱼的幼虫和成虫中的增殖能力均明显减弱，病理反应也非常微弱，说明FdmR对海分枝杆菌维持自身毒力有很重要作用。结合体外结合实验和体内转录激活实验发现，FdmR是一个转录抑制因子，并通过直接响应脂酰辅酶A的浓度负调控其靶基因。为了研究其中的调控机制，我们利用系统的定量代谢组学方法，测定在脂肪酸为生长碳源时，FdmR突变株的代谢物浓度和代谢流量的变化。结果显示，FdmR的缺失引起胞内短中链的脂肪酸显著积累，而长链脂肪酸的浓度则明显降低。相应的，FdmR突变株的中心碳代谢流量也明显大于野生型的，中心碳代谢的一系列代谢物也有显著的积累。结合脂质组的方法，我们还检测了胞内脂质的变化，结果显示FdmR突变株中典型的与毒力相关脂质和细胞壁重要脂质的含量均显著降低。由此，我们认为FdmR在脂肪酸分解代谢和脂质合成途径中扮演一个重要的“阀门”角色（图2B），在细菌利用脂肪酸时将更多的流量从脂肪酸氧化引入到合成途径，不仅可以避免过度脂肪酸氧化造成的毒性中间代谢物的积累，还能合成足够丰度和长度的与毒力相关的脂质以及重要的细胞壁组分。此外，FdmR在所有分枝杆菌中高度保守，且在临床菌株中突变率极低，因此FdmR可能成为一个潜在的药物靶点。

年度代表性论文：

1. Xiaoqun Nie^#, Liliang Xia^#, Fang Gao^#, Lixia Liu, Yi Yang, Yingying Chen, HuangqiDuan, Yaxian Yao, Zhiwei Chen, Shun Lu*, Ying Wang*, Chen Yang* (2020) Serum metabolite biomarkers for prediction of responses to PD-1 and PD-L1 blockades in non-small-cell lung cancer. Submitted.

2. Xiaoqun Nie^#, Qiang Hua, Ping Xu, Chen Yang* (2020) Biological insights into non-model microbial hosts through stable-isotope metabolic flux analysis. Current Opinion in Biotechnology, in press.

3. Bin Yang^#, Xiaoqun Nie, Youli Xiao, Yang Gu, Weihong Jiang, Chen Yang* (2020) Ferrous iron-activated transcriptional factor AdhR regulates redox homeostasis in Clostridium beijerinckii, Applied Environmental Microbiology, in press.

4. Ningning Zhuang^#, Hao Zhang^#, Lingting Li, Xiaoxian Wu, Chen Yang*, Yu Zhang* (2020) Crystal structures and biochemical analyses of the bacterial arginine dihydrolaseArgZ suggests a "bond rotation" catalytic mechanism. Journal of Biological Chemistry 295: 2113-2124.

5. Bin Yang^#, Xiaoqun Nie, Yang Gu, Weihong Jiang, Chen Yang* (2020) Control of solvent production by sigma-54 factor and the transcriptional activator AdhR in Clostridium beijerinckii. Microbial Biotechnology 13: 328-338.