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合成生物催化剂工程研究组

研究组组长：杨晟 研究员

主要研究方向及内容：新一代DNA测序与低成本DNA合成技术提供了海量基因资源与快速廉价的基因获取手段，为设计和创制理想的工程细胞提供了近乎无限的可能性。我们课题组的研究方向是开发微生物基因组编辑工具，用于更快地构建或重构细胞以理解其高效功能背后的遗传与生化机制，进而设计新一代的工程细胞，助力绿色化学与生物医药应用。

研究队伍：

工作人员：杨俊杰、陈军、何慧琪

博士后：孙兵兵

研究生：张姣、张译文、吴联、杨思琪

联合培养生：徐佳琪

 

年度研究进展

1）快速染色体多拷贝整合系统革新细胞工厂构建方式

基因剂量的优化是提高合成生物催化剂性能的重要环节。由于质粒存在可用复制子有限、拷贝数不稳定等局限性，因此，将基因表达盒整合至染色体上进行剂量优化或许是个更好的选择。然而，即使在模式菌株大肠杆菌中，染色体上每轮整合也至少需要两天，难以快速获取含一系列不同拷贝数的基因表达盒的工程菌株进行筛选优化。

基于新表征的I-F和V-K型CRISPR转座系统，我们建立了CRISPR相关转座介导的染色体多拷贝整合方法（Multicopy chromosomal integration using CRISPR-associated transposases，简称MUCICAT）。首先，我们在大肠杆菌中选择天然多拷贝的插入序列作为靶向位点，尝试使用以上两个系统进行多拷贝整合。在大肠杆菌Pir1中，使用I-F系统靶向5拷贝的IS1序列位点，经过一轮转座，发现仅整合1拷贝货物基因，传代后也未能分离得到多拷贝插入的菌株。然而在大肠杆菌BL21(DE3)中，使用V-K系统靶向染色体28个拷贝的IS1序列位点，可以在一轮转座后得到最多整合4拷贝货物基因的菌株。随着传代时间的延长，货物基因在染色体的插入拷贝数也不断增加，传代8次后得到染色体插入16拷贝货物基因的菌株。之后，我们尝试组装多个crRNA为crRNA 阵列，靶向染色体不同的期望位点，发现靶向染色体8个不同位点时，经过5轮传代转座，可获得8位点全部插入的菌株。最后，我们使用MUCICAT技术在大肠杆菌BL21(DE3)中进行工业酶葡萄糖脱氢酶的表达优化，建立不同拷贝数的菌株文库并筛选后，染色体6拷贝整合菌株的酶活可达目前主流pET24a质粒表达的2.6倍。此外，我们为测试MUCICAT技术能否拓展至更多的细菌中，在维生素C生产方面有应用潜力的柠檬塔特姆氏菌中进行了测试，靶向该菌染色体上13拷贝的多拷贝位点时，结果显示一轮传代后100%的菌株的13个位点均整合了货物基因，说明MUCICAT技术有希望应用于更多的细菌中。

总体来说，MUCICAT依赖其可编辑性、无筛选标记、定点快速的染色体多拷贝能力，有望成为合成生物学与代谢工程中加速菌株改造、优化菌株性能的有力工具，革新细胞工厂构建方式。

年度代表性论文：

1. Liu J, Jiang Y, Chen J, Yang J, Jiang W, Zhuang W, Ying H, Yang S. Metabolic engineering and adaptive evolution of Clostridium beijerinckii to increase solvents production from corn stover hydrolysate. Journal of agricultural and food chemistry 2020.doi: 10.1021/acs.jafc.0c03048

2. Sun XM, Zhang ZX, Wang LR, Wang JG, LiangY, Yang HF, Tao RS, Jiang Y, Yang JJ, Yang S. Downregulation of T7 RNA polymerase transcription enhances pET-based recombinant protein production in Escherichia coli BL21 (DE3) by suppressing autolysis. Biotechnol Bioeng 2020.doi: 10.1002/bit.27558

3. Wen Z, Ledesma-Amaro R, Lu M, Jiang Y, Gao S, Jin M, Yang S. Combined evolutionary engineering and genetic manipulation improve low pH tolerance and butanol production in a synthetic microbial Clostridium community. Biotechnology and Bioengineering 2020, Doi: 10.1002/bit.27333

4. Wen Z, Ledesma-Amaro R, Lu M, Jin M, Yang S. Metabolic Engineering of Clostridium cellulovorans to Improve Butanol Production by Consolidated Bioprocessing. ACS synthetic biology 2020, 9 (2), 304-315.

5. Zhang J, Qian F, Dong F, Wang Q, Yang J, Jiang Y, Yang S. De Novo Engineering of Corynebacterium glutamicum for l-Proline Production. ACS synthetic biology 2020, Doi: 10.1021/acssynbio.0c00249

6. Zhang Y, Sun X, Wang Q, Xu J, Dong F, Yang S, Yang J, Zhang Z, Qian Y, Chen J, Zhang J, Liu Y, Tao R, Jiang Y, Yang J, Yang S. Multicopy chromosomal integration using CRISPR-associated transposases. ACS synthetic biology 2020.doi: 10.1021/acssynbio.0c00073