真菌分子遗传与合成生物学研究组----中国科学院分子植物科学卓越创新中心/中国科学院上海植物生理生态研究所

真菌分子遗传与合成生物学研究组

研究组长：周志华，研究员

主要研究方向及内容：在多年从事微生物元基因组及微生物资源研究开发工作的基础上，课题组近年来完成了从微生物分子生态与微生物资源向分子生物学与合成生物学的转变。目前，课题组的研究方向聚焦于生物元件的挖掘与鉴定、真菌底盘细胞的分子生物学及基因组编辑的研究。具体而言，真菌被广泛应用于医药、食品、能源和轻工等诸多领域。里氏木霉具有强大的蛋白合成与分泌能力，酿酒酵母为天然产物生物合成的优良底盘细胞。本课题组近期的研究目标为：基于碳水化合物活性酶及天然化合物合成相关的基因资源（生物元件）挖掘与功能鉴定，构建木质纤维素降解酶/酶系和重要萜类等天然化合物合成的真菌细胞工厂。主要研究方向包括：（1）生物元件的规模化挖掘、功能鉴定与改造；（2）里氏木霉中纤维素酶合成与分泌调控机制的研究及其遗传改造；（3）重要天然化合物的酵母细胞工厂的设计、构建与适配性优化。课题组目前承担科技部重大专项1项，参与1项新药创制重大专项及承担2项自然科学基金面上项目、1项自然科学基金青年项目。

研究队伍：

工作人员：严兴（研究员）、王燕（副研究员）、王平平（助理研究员）、吴世文（助理研究员）、沈潇（实验师，日常管理合成生物学重点实验室资源库）

博士后：于璐博士

合作研究者：杨成帅博士

研究生：柴顺星、李晓东、朱志华、李超静、肖美丽、魏文苹、樊震鋆、王引梅、熊伦艺、马迩东

联合培养：邢宏观（华东理工大学）、田尔诺（华东理工大学）、王加莉（河南大学）、徐珍珍（河南大学）

年度研究进展

1）UGT94家族广泛参与人参皂苷第二位糖的延伸

目前已经从人参属植物中分离到了150多种人参皂苷，人参皂苷也因其多种多样的糖基化修饰而展现出不同的生物活性。我们从人参材料中克隆了的46 氨基酸序列高度相似的糖基转移酶UGT94家族基因，并对它们进行了体外功能鉴定。结果表明这46个PgUGT94能够在原人参二醇（PPD）型皂苷的C3-O-glc 或/和 C20-O-glc以及原人参三醇（PPT）型皂苷的C6-O-glc 或/和 C20-O-glc上延伸一分子葡萄糖，并且它们表现出不同的催化效率。为了验证UGT94家族的多样性是否在单一植株存在，我们利用单株人参和单株三七对UGT94家族进行了系统性的克隆和功能鉴定，分别从单株人参和单株三七中获得了26和51个UGT94基因。研究结果表明：这些UGT94基因同样表现出了序列的多样性与功能的多样性。这表明人参属植物中的确存在着一组序列和功能具有多样性的UGT94，负责人参皂苷第二位糖的延伸。系统进化分析表明这些UGT94分为三个分支，对应着不同的生物活性。进一步的功能鉴定表明其中某些UGTs还可以催化一分子木糖、阿拉伯糖或鼠李糖的延伸。基于这些功能鉴定的UGT94，我们系统解析了一系列人参皂苷的生物合成途径，为人参皂苷细胞工厂的构建及解析植物中UGT家族的多样性形成机制奠定了基础。

2）利用化学小分子促进基于核糖核蛋白（RNP）的丝状真菌基因编辑效率

近年来，RNA引导核酸酶Cas9引起DNA双链断裂修复已成为一种常用的基因组编辑手段。通过体外组装Cas9-CRISPR gRNA复合蛋白的RNP（ribonucleoprotein）技术，也可成功对一些真菌的基因组进行直接编辑。然而，由于真菌细胞较小，复合蛋白直接转化真菌的原生质体的转化效率特别低，核糖核蛋白（RNP）应用于真菌基因组编辑仍面临困难。我们建立了基于添加化学试剂来提高丝状真菌RNP法基因组编辑效率的优化策略，加入TritonX-100及延长孵育时间的方法大大提高了RNP的膜穿透效率，从而显著提高了RNPs的转化效率，优化后的方法对里氏木霉及虫草菌的编辑效率达到了100%。进一步优化后该方法在里氏木霉中仅需要20bp的同源片段即可实现高效同源重组，重组效率达到了56.52%，在不添加任何筛选标记的情况下该方法的敲除效率也达到了7.37%。然而，对于容易在孢子和原生质体中形成多核结构的米曲霉，仅仅添加TritonX-100还是难以获得基因编辑的纯合子。我们通过加入抑制有丝分裂和细胞分裂的化学物质进一步优化了RNP基因组编辑方法。肌醇在真核细胞中扮演着重要的角色，肌醇的添加促进真菌细胞壁的形成，提高单核细胞的比例。另一方面，苯菌灵可有效抑制丝状真菌的有丝分裂。在优化的方法中我们通过添加肌醇或苯菌灵成功地提高了基因组编辑后米曲霉纯合转化子的比例（肌醇可将纯合子比例从0%提升至40%，苯菌灵可从0%提升至71.43%）。优化后的RNP转化方法相比我们课题组在丝状真菌中首次报道的相关技术具有更好的通用性(Zou et al. 2015,cell discovery)，可广泛的应用于食品和医药行业，具有优良的商业化前景。

3）利用蘑菇来源GH12家族纤维素酶缓解里氏木霉纤维素酶制剂的产物抑制效应

木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源，高效的木质纤维素降解酶酶系是综合开发这一资源的关键。生物炼制过程中产生的水解产物引起相关酶系的产物抑制效应，导致炼制过程效率降低，增加了综合利用的成本。课题组尝试用一种蘑菇类大型真菌漏斗多孔菌（Polyporusarcularis）来源的具有产物激活效应的糖基水解酶12家族（GH12）纤维素内切酶（PaCel3A）来缓解纤维素酶制剂的产物抑制效应，通过迭代饱和突变等人工定向进化方法提高其热稳定性，并在纤维素酶工业菌株里氏木霉中重组表达，提高了木霉酶系对预处理水稻秸秆的糖化效率。通过和木霉自身GH12家族纤维素酶比较发现，蘑菇来源的GH12纤维素酶是通过自身活性受产物激活的这一机制来缓解纤维素酶酶系的产物抑制效应的。由于大多数蘑菇和常见工业纤维素酶生产菌株在利用木质纤维素的策略是不同的，本研究也预示着蘑菇可能是存在着很多特殊功能且具有工业应用前景的酶类。

年度代表性论文：

1.Yongjun Wei, Yuqian Wu, Lei Zhang, Zhihua Zhou , Haokui Zhou * andXing Yan*，Genome recovery and metatranscriptomic confirmation of functionalacetate-oxidizing bacteria from enriched anaerobic biogas digesters，Environmental Pollution,2020, 265，1-10.

2. ChengshuaiYang，Chaojing Li, Wei Wei, Yongjun Wei, QunfangLiu,Guoping Zhao, JianminYue, XingYan*, Pingping Wang* andZhihua Zhou*，the unprecedented diversity of UGT94？family UDP？glycosyltransferases in Panax plants and their contribution to ginsenoside biosynthesis，Scientific Reports，10，1-11.

3. Gen Zou#, Meili Xiao#, Shunxing Chai, Zhihua Zhu, Ying Wang and Zhihua Zhou*，Efficient genome editing in filamentous fungi via an improved CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein method facilitated by chemical reagents, Microbial Biotechnology. 2020, doi: 10.1111/1751-7915.13652.

4. Gen Zou#, DapengBao#, Ying Wang#, Sichi Zhou , Meili Xiao, Zhanshan Yang, Yinmei Wang, Zhihua Zhou*, Alleviating product inhibition of Trichodermareeseicellulase complex with a product-activated mushroom endoglucanase, Bioresour Technol. 2020 Sep 15;319:124119. doi: 10.1016/j.biortech.2020.124119.